Таблица 1
Характеристики пациентов, включенных в данное исследование
Рост клеток, in vitro-инфекция C trachomatis
Клетки HEp-2 поддерживают активный рост C trachomatis8,14, то есть Chlamydia, инфицирующий эту клеточную линию, обычно проходит через цикл развития. Почти конфлюентные монослои клеток HEp-2 инфицировали сероаром C trachomatis K при множественном заражении 1: 1 стандартным образом.8,9 Зараженные культуры собирали через 12 часов после заражения, а клеточные гранулы замораживали при - 80 ° C до обработки для анализа. C trachomatis, инфицирующий нормальные человеческие периферические моноциты в культуре, переходит в состояние стойкой инфекции к 3-му дню после заражения .7,8,9,10. Образцы крови были закуплены у добровольцев-доноров по утвержденному протоколу, а моноцитарные клетки были приготовлены и введены в культуру, как описано нами6,7,8,9,10; протокол был одобрен Медицинской школой Университета штата Уэйн. Почти конфлюентные монослои моноцитов были инфицированы при множественности заражения 1: 1 с помощью C trachomatis serovar K, а зараженные культуры собирали на 5-й день после заражения; клеточные гранулы замораживали при -80 ° С до обработки. Чтобы быть уверенным, что хламидии, заражающие моноциты в этих экспериментах, вошли в постоянное состояние, транскрипты из генов trachomatisdnaA, polA, omp1, ftsK, pyk и генов CA оценивали по обратной транскриптазе (RT) -PCR (см. Ниже); все такие транскрипты отсутствовали, как ожидалось, за исключением тех, что получены от dnaA и polA, которые выражаются как при активной, так и в постоянной инфекции.
Подготовка и анализ РНК / кДНК
Все препараты нуклеиновой кислоты были получены из зараженных хламидией гепта-2 и человеческих гранул клеток моноцитов и из образцов синовиальной ткани, как описано ранее.8,9. Чистую РНК получали из аликвот каждого препарата путем обработки ДНКазой (RQ1 ДНКаза, Promega Biotech , Madison WI, USA) с последующей экстракцией в феноле: хлороформе и сбора осаждением этанолом. Обратную транскрипцию полных препаратов РНК к кДНК проводили с использованием фермента MuLV и случайных гексамеров в качестве праймеров (Invitrogen, Carlsbad CA, USA), как описано.10,14
Препараты кДНК подвергали количественному анализу RT-PCR в реальном времени для 16 целевых генов trachomatis C, используя зеленый метод SYBR.10,14 В таблице 2 представлены интересующие кодирующие последовательности и праймерные системы, используемые в анализах. Каждый анализ RT-PCR в реальном времени для каждого целевого гена выполнялся в трех повторностях независимо. Данные были нормированы на хламидийную 16S рРНК, как описано 8,10,14; данные для конкретных транскриптов во всех тестах на моноциты и пациента были проиндексированы до уровня этого транскрипта в C trachomatis, активно растущего в течение 12 часов в клетках HEp-2. Анализы проводили с использованием детектора последовательности 7700 PE Biosystems (Foster City, CA, USA); данные анализировались с использованием программного обеспечения для анализа последовательности версий 1.9 от PE Biosystems.
Таблица 2
C trachomatis гены и последовательности праймеров для RT-PCR в реальном времени
РЕЗУЛЬТАТЫ
C гены trachomatis, ортологичные генам, связанным с персистенцией М туберкулеза
Чтобы определить, имеет ли какой-либо из 194 генов туберкулеза М, идентифицированных как необходимый для роста и стойкости in vivo у мышей22, имеют ортологи в C trachomatis, мы выполнили BLAST-оценку каждой идентифицированной микобактериальной кодирующей последовательности против полного хламидийного генома (http: //
www.stdgen.lanl.gov, доступ к которому был получен 7 декабря 2005 года). Из 194 генов мы определили 67 ортологов с значениями Expect 10-1 или выше, что составляет 35% от общего числа оцениваемых генов. В таблице 3 приведен полный список идентифицированных хламидийных последовательностей, их родственных генов в туберкулезе М и значения ожиданий. Хламидийные ортологи миобактериальных генов, связанных с персистенцией, относятся к общим категориям, аналогичным тем, которые были изучены в исследовании туберкулеза М, то есть генам, кодирующим продукты, участвующие в синтезе или модификации оболочки оболочки, синтезе кофакторов, транспорте, трансляции и т. Д.22 Интересно , девять генов, определяющих белки неизвестной функции, были идентифицированы в геноме C trachomatis, все, кроме одного, которые соответствовали аналогично неизвестным генам в M туберкулезе. Не выявлено генов, определяющих компоненты системы хламидийного типа III, но был идентифицирован secA, компонент кажущейся системы секреции II типа (но см. Ниже). Было показано, что три гена микобактерий, связанные с секрецией, регулируются в более раннем исследовании, включая secA2.
Данное сообщение закреплено и будет отображаться в верху каждой страницы темы.